즉각적인 생물막 제거(iCBiofilm): 박테리아 및 곰팡이 생물막 이미징을 재검토하기 위한 광학적 접근 방식

May 19, 2024

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 38(2023) 이 기사 인용

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단일 세포 해상도의 전체 생물막 이미징은 세포 이질성의 시스템 수준 분석, 주요 매트릭스 구성 요소 기능 식별, 면역 세포 및 항균제에 대한 반응에 필요합니다. 이를 위해 우리는 생물막 순간 제거(iCBiofilm)라고 불리는 전체 생물막 제거 및 이미징 방법을 개발했습니다. iCBiofilm은 굴절률 일치 매체에 생물막 샘플을 담그는 간단하고 빠르며 효율적인 방법으로, 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 즉각적인 전체 생물막 이미징을 가능하게 합니다. 우리는 또한 비고정 iCBiofilm을 개발하여 생물막 발달과 항균제 작용을 실시간 및 동적 영상화할 수 있었습니다. iCBiofilm은 수백 마이크로미터 두께의 생물막 내 형광 단백질, 면역염색 매트릭스 성분, 형광 표지 세포의 다색 이미징에 적용할 수 있습니다. iCBiofilm은 박테리아에서 곰팡이 생물막까지 확장 가능하며 생물막-호중구 상호 작용을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 iCBiofilm은 생물막의 역학과 기능을 조사하고 박테리아 및 곰팡이 생물막 형성을 재검토하는 데 중요한 발전을 나타냅니다.

박테리아 생물막은 비생물적 또는 생물적 표면과 공기-액체 경계면에 형성된 고도로 조직화된 박테리아 공동체입니다. 의료용 임플란트 및 신체 조직 표면의 박테리아 생물막은 식세포, 보체 및 항균 펩타이드를 포함한 항균제 및 숙주 방어 시스템에 내성을 가질 수 있습니다. 이러한 현상은 카테터 관련 혈류 감염, 요로 감염, 심내막염 등 다양한 만성 인간 감염 질환을 유발합니다1,2,3. 따라서 임상 환경에서 생물막이 형성되면 이병률과 사망률이 증가하여 의료 시스템에 상당한 재정적 부담이 가해집니다. 또한, 생물막은 식수 분배 시스템의 유지 관리에서 발생하는 것과 같은 기술적 작업에서 물류 문제를 일으킬 수 있습니다4. 그러나 생물막은 발효 식품 생산, 유기 화합물의 생물 전환 과정 및 폐수 처리와 같은 인간 산업에 유익한 기능도 가지고 있습니다5. 따라서 생물막 형성의 제어 및 분석을 위한 혁신적인 전략의 개발은 다양한 분야에서 중요합니다.

생물막의 박테리아 세포는 단백질, 다당류 및/또는 세포외 DNA와 같은 세포외 고분자 물질(EPS)을 포함하는 일반적으로 자체 생산된 매트릭스에 싸여 있는 것으로 믿어집니다. EPS는 미생물-미생물 응집력 및 미생물-표면 접착의 자극을 통해 생물막 구조의 형성 및 유지에 다양한 역할을 합니다6. 그러나 생물막 매트릭스 구성 요소의 3차원 분포와 내장된 박테리아 세포의 이질적인 특성은 완전히 이해되지 않았습니다. 더욱이, 생물막의 이질성 또는 세포 분화는 일반적으로 받아들여지는 개념이지만, 두꺼운 생물막의 경우 현미경 규모에 대한 직접적인 증거를 얻기가 어려웠습니다.

따라서 신속하고 효율적인 생물막 시각화를 가능하게 하는 전략의 개발은 다른 미생물 및 숙주와의 상호 작용 및 항균제에 대한 반응을 포함하여 생물막의 구조와 기능을 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)과 같은 광학 현미경(OM)과 형광 프로브가 결합된 광시트 현미경을 통해 연구자들은 3차원 생물막 구조를 연구하고 생물막에 대한 현재 이해에 상당한 기여를 할 수 있었습니다7,8,9 ,10, 단일 세포 수준에서 두꺼운 생물막의 이미징은 기존 OM 기술을 사용할 때 더 깊은 영역으로의 빛 침투가 제한되기 때문에 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 또한, 수침 렌즈를 사용하는 표준 CLSM은 비브리오 콜레라 생물막11,12의 실시간 단일 세포 해상도 이미징을 가능하게 했습니다. 이 방법은 다른 세균성 생물막의 이미징에 적용될 수 있습니다.

60 μm thickness were clearly visualized in 35.2% (w/w) iohexol (Fig. 1d). Similarly, a ThT-stained biofilm was clearly observed at all thicknesses with single-cell resolution (Supplementary Movie 1). Most notably, the opaque biofilm became transparent immediately after adding 35.2% (w/w) iohexol alone (Supplementary Movie 2), indicating that the RI-matching medium was sufficient to lend transparency to the S. aureus biofilm without removing some biomolecules. This simple and efficient method to visualize thick biofilms using a detergent-free, RI-matching reagent alone was termed iCBiofilm. Of note, the RI-matching reagent is not limited to iohexol (Supplementary Fig. 2 and 3). Diatrizoate, iodixanol, iopromide, iopamidol, and ioversol showed high clearing capacity (Supplementary Fig. 2a). These reagents improved imaging of the thick biofilm compared with PBS (Supplementary Fig. 2b). Previously, a water immersion lens was used to analyze dynamics of a live V. cholera biofilm11,12, but we could not observe any differences in the visible thickness between oil and water immersion lenses, at least in the case of the PBS-immersed S. aureus biofilm (Supplementary Fig. 2b). Therefore, we think that matching of RI between biofilms and the surrounding solution is more important for whole-biofilm imaging rather than the choice of an objective lens. As mentioned below, the RI-matching reagent can be changed for experimental purposes./p>

100 μm at a single-cell resolution./p>

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